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新型GRAB荧光探针用于检测胞外ATP的时空动态变化

三磷酸腺苷(ATP)、二磷酸腺苷(ADP)、腺苷(Adenosine,Ado)等嘌呤类分子细胞内外广泛存在。胞内的嘌呤类分子主要负责调控细胞能量代谢等过程;而胞外的嘌呤类分子则作为信号分子(被称为“嘌呤类递质”),通过作用在其相应受体调节呼吸调控、味觉感受、睡眠等生理活动;嘌呤类递质及其受体还参与调节癫痫、疼痛、炎症反应、脑外伤和缺血等病理状态。

三磷酸腺苷(ATP)、二磷酸腺苷(ADP)、腺苷(Adenosine,Ado)等嘌呤类分子细胞内外广泛存在。胞内的嘌呤类分子主要负责调控细胞能量代谢等过程;而胞外的嘌呤类分子则作为信号分子(被称为“嘌呤类递质”),通过作用在其相应受体调节呼吸调控、味觉感受、睡眠等生理活动;嘌呤类递质及其受体还参与调节癫痫、疼痛、炎症反应、脑外伤和缺血等病理状态。此外,嘌呤能信号失调还与抑郁、精神分裂症等精神类疾病密切相关。迄今,解密嘌呤能信号传递功能的一大技术瓶颈是缺乏灵敏、特异且非侵入性的工具,以高时空分辨率地报告嘌呤类递质的动态变化。

北京大学李毓龙实验室在Neuron杂志在线发表了题为“A sensitive GRAB sensor for detecting extracellular ATP in vitro and in vivo”的研究论文,报道了新型基因编码的ATP探针GRABATP1.0的开发和在体外及活体动物的应用。李毓龙实验室自2018年以来,先后开发了针对乙酰胆碱、多巴胺、去甲肾上腺素、腺苷、五羟色胺、内源大麻素等神经递质或调质的荧光探针,此次发表的GRABATP1.0是其又一力作,进一步扩展了GRAB系列荧光探针家族。

在这一工作中,李毓龙实验室运用其先前设计的GRAB探针策略(GPCR Activation-Based sensor),基于人源ATP受体P2Y1和循环重排的绿色荧光蛋白cpEGFP开发了ATP探针GRABATP1.0(简称为ATP1.0)。在体外培养的HEK293T细胞、原代神经元及星形胶质细胞中,ATP1.0探针均表现出优异的细胞膜定位。神经元表达的ATP1.0对外源加入的ATP及ADP有~780%的信号响应、~80 nM的亲和力(EC50),及高度的分子特异性(图1)。此外,ATP1.0能够在亚秒级别响应胞外ATP浓度的变化。

ATP1.0探针能否用来检测内源释放的ATP呢?作者从原代培养的海马细胞入手,发现ATP1.0能够检测到机械刺激及低渗透压刺激引发的ATP释放,药理学实验及突变型探针实验进一步验证了ATP1.0检测信号的特异性(图2)。有意思的是,在不给予额外刺激时,ATP1.0也能灵敏地记录到直径约为30微米的自发性ATP释放事件,表明ATP的释放具有化学分子特异和空间特异性。

ATP1.0探针能否在活体动物加以运用呢?过去的研究发现,当细胞受到损伤时,胞内毫摩尔级别的ATP被释放胞外,作为“危险信号”被周围的胶质细胞感受,从而激活小胶质细胞释放趋化因子等,产生免疫反应。胶质细胞上表达的嘌呤类受体在小胶质细胞激活、迁移及分泌信号因子过程中发挥重要作用。那么,在这一过程中,信号分子ATP的传播和小胶质细胞的迁移是如何动态并变化的?作者将ATP1.0探针表达在斑马鱼中,通过激光照射引发局部损伤时发现ATP的释放呈现“波状”传播;通过将绿色ATP1.0探针表达在红色荧光蛋白标记小胶质细胞的转基因斑马鱼中,能够直观地检测到随着ATP信号的传播小胶质细胞的迁移过程。

当大脑处于疾病状态时,ATP的释放又会呈现什么样的变化?如上所述,嘌呤能信号在免疫中扮演着重要角色。为了检测免疫反应过程中大脑中ATP信号的变化,作者通过腹腔注射脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)的方式引发小鼠的系统性免疫反应,同时通过AAV病毒介导的方法将ATP1.0表达在小鼠的大脑皮层,并借助双光子成像记录ATP的信号。有意思的是,LPS注射后,小鼠大脑皮层呈现出强烈、但空间特异的ATP信号上升现象。


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